采用CRISPR/Cas9系统进行目的基因（外源基因，抗性基因和荧光标志等）的定点敲入，是通过提供外源模板（Donor载体）依靠细胞自身的修复机制NHEJ（非同源末端连接）和HDR（同源同组）完成的。在哺乳动物细胞中，CRISPR/Cas9介导的NHEJ对标记基因的插入概率明显高于HDR修复机制。我们的技术团队在以NHEJ介导的目的基因敲入细胞株构建中具有丰富的经验，可实现敲入概率30%以上，通过抗性筛选后的基因敲入概率可达80%以上。

一、服务内容:
      基因敲入细胞系/株的鉴定基因敲入的实验方案的设计
      CRISPR/Cas9和Donor敲入载体的构建
      CRISPR/Cas9载体效率的评估
      CRISPR/Cas9和Donor载体目标细胞的转染
      基因敲入细胞系的筛选
      基因敲入细胞株的筛选
      基因敲入细胞系/株的鉴定

二、服务流程:

三、技术路线：
 

四、 交付内容：
      1、实验报告内容：
      基因敲入载体和donor载体构建报告及测序结果
      基因敲入细胞系/株筛选实验报告
      基因敲入细胞系/株鉴定报告

      2、产品内容：
      基因敲入载体（质粒或菌液）
      基因敲入细胞系或单克隆细胞株1-2株

五、案例分享

案例1：293T-AAVS1-Cas9细胞株
       293T-AAVS1-Cas9细胞株是采用CRISPR技术介导的基因同源重组构建的，基因插入位点位于人PPP1R12C基因的第一个内含子上（AAVS1位点）。在该位点中插入外源基因片段具有稳定表达、不影响其他基因转录的优点。与慢病毒感染技术相比，AAVS1位点基因插入稳定表达，可以有效控制目的基因表达水平，实现目的基因单、双拷贝以及细胞生理水平表达等，弥补慢病毒感染细胞中目的基因表达拷贝数不确定，表达水平不可控的缺点。  

1.1  293T-AAVS1-Cas9细胞株构建技术路线

       pspCas9-AAVS1-gRNA和pUC-AAVS1-spCas9质粒共转染293T细胞后，通过嘌呤霉素持续筛选获得具有抗性细胞系，在此基础上挑取单克隆细胞进行扩增，最终通过基因组和蛋白质鉴定获得稳定表达Cas9的细胞株，即293T-AAVS1-Cas9细胞株。技术路线如下图：

1.2 Cas9蛋白稳转株产品特点：

•       稳定表达spCas9蛋白

•       单克隆细胞株

•       基因切割效率稳定

•       使用只需转染gRNA

•       CRISPR修饰文库筛选

1.3 293T-AAVS1-Cas9细胞株WB鉴定

1.4 Cas9稳定表达细胞株现货

案例2: Hul-7 Cells-A gene-3UTR-ires-GFP细胞株
      Hul-7 细胞A基因3‘UTR区域插入IRES-GFP序列，通过切口末端拼接的方式将GFP插入到目的基因的3‘UTR区域，双gRNA系统，Cas9/gRNA 1介导基因组目的片段切割，Cas9/gRNA 2介导Donor载体，双载体共转染Hul-7细胞，流式细胞分选GFP+细胞，单克隆收集并鉴定。
2.1 Hul-7 Cells-A gene-3UTR-ires-GFP细胞株构建技术路线

      Hul-7 Cells-A gene-3UTR-ires-GFP细胞基因型和表型鉴定

流式细胞分选单克隆细胞并收集在24孔板，左图为流式分选图，右图为单克隆细胞显微成像图和扩增后PCR鉴定图谱。

2.2 基因插入细胞系现货