siRNA（short/small interfering RNAs），siRNA有时称为短干扰RNA或沉默RNA，siRNA是一种长20到25个核苷酸的双链RNA，目前已知siRNA主要参与RNA干扰(RNAi)现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。
siRNA的结构示意图
外源性或内源性双链RNA（dsRNA）被RNaseIII（例如Dicer）切割成约21-25nt具有活性的siRNA结构。随后，Dicer将在RNA结合蛋白TRBP的帮助下将双链siRNA加载到Argonaute（AGO2）蛋白，形成复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。然后，siRNA将解开双链，其反义链与靶mRNA结合后，AGO2将特异性降解靶mRNA，从而抑制其翻译。最后，被切除的靶mRNA被释放，RISC被回收，使用相同的加载引导链再进行几轮靶向降解。此外，siRNA可以在RNA聚合酶的作用下再次形成dsRNA，从而重新参与以上过程。
RISC中发挥沉默靶基因作用的主要部分是Argonaute蛋白（AGO2）。为了实现siRNA介导的沉默，AGO2需要连接siRNA反义链，切掉随从链，随后在保持与反义链结合的情况下，经历多个靶mRNA识别、切割和释放循环。AGO2具有三个功能域，PAZ、MID和PIWI，其中PIWI结构域具有RNaseH样的折叠情况，是赋予其切割活性的功能域。PAZ结构域具有RNA结合作用，能够识别单链RNA的3’端，起到了铆定向导链的3’端的作用，5'端则插入MID和PIWI结构域之间，从而便于PIWI结构与实现切割功能。
二、siRNA的设计原则
siRNA是否能起到特异性沉默目的基因作用，siRNA序列的设计，是关键的因素之一，或者说是最重要的因素。
以下是设计siRNA遵循的一般原则和步骤：
1. 确定靶基因，并针对靶基因序列进行一些简单的生信分析，了解该mRNA转录本的基本结构信息，及这个基因的不同转录本，基因或基因上SNP位点多态性，功能域等一些基础信息；并针对该基因，查询相关数据库，看是否有已验证过的siRNA序列。有则尽量优先用验证有效的序列，没有则自行设计；
2. 一般首选靶基因的CDS区域作为siRNA的同源区，其次才选择3’UTR；一般不建议选择5’UTR；
3. siRNA碱基组成方面，一般建议GC含量在（30-52%），并避免单碱基连续4个以上的重复区域，一般选择AA开始区域（这样对应的反义链以uu作为3’末端）；
4. 如果直接合成siRNA，则注意退火后的siRNA是5’缩进，3’突出的；一般是突出2个碱基；
5. 序列内部（即siRNA核心序列）避免稳定的二级结构；
6. 候选siRNA区域确定后，还需要对本种属做对库搜索，避免与其它基因同源；
7. 一个靶基因，需要选定3-5个合格的siRNA位点供筛选；即需要合成3-5套siRNA或构建3-5个shRNA载体；
8. 一般还需要提供一个阴性对照（阴性对照最好是与siRNA序列碱基组成相似但与靶基因及种属其它基因没有同源性）；最好还有一个阳性对照（阳性对照选用同种属其它靶基因已验证过的siRNA序列）。
三、siRNA的体外定制-化学合成siRNA
siRNA便宜且实用，可作为我们预实验或实验初期的常规工具。合成siRNA应用广泛，这种方法的得率和纯度都比较高。对合成siRNA还可以进行一系列化学修饰以提高siRNA的稳定性、降低脱靶效应，以及（或者）阻止激活天然免疫反应。在用于细胞之前，合成的正义和反义siRNA需在体外复性形成双链siRNA。
基恩科（Genecarer）生物RNAi的服务包括单条siRNA定制、三保一套餐（定制三条siRNA且保证其中至少一条能够实现良好的敲减效果）、四保一套餐等。由于siRNA有一定的脱靶率，且其敲减效率可能与具体的靶向序列有一定关系，因此，除非有在可靠文献上找到详细的siRNA序列，否则，建议直接选择三保一或四保一套餐。
通过在NCBI上查询了需要敲减的目的基因的CDS序列或是基因ID或是NM号之后，设计siRNA，确认无误后项目立项，5-7天即可合成一套成品siRNA。
以三保一套餐为例，会收到4个siRNA：
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套餐组成 |
交付内容介绍 |
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靶基因siRNA oligos |
根据目的基因，设计合成3-4对siRNA。 |
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阴性对照 siRNA oligos |
阴性对照为靶细胞无同源性的siRNA，一个严谨的RNAi实验，阴性对照是必不可少的。 |
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阳性对照 siRNA |
一般为内参基因GAPDH的有效siRNA，用以检测实验过程中各操作步骤的可靠性。 |
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FAM荧光标记阴性对照siRNA Oligos |
带荧光基团的阴性对照，主要用于预实验检测目的细胞siRNA的转染效率。转染后6-12 通过荧光显微镜观察siRNA的转染效率。 |
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阴性对照 |
正义链 |
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT |
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反义链 |
ACGUGACACGUUCGGAGAATT |
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阳性对照 |
正义链 |
AGAAUGGGAAGCUUGUCAUCAATT |
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反义链 |
UUGAUGACAAGCUUCCCAUUCUTT |
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阳性对照 |
正义链 |
GUAUGACAACAGCCUCAAGTT |
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反义链 |
CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT |
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阳性对照 |
正义链 |
GUAAAGACCUCUAUGCCAATT |
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反义链 |
UUGGCAUAGAGGUCUUUACTT |
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四、siRNA的存储与溶解
siRNA储存
siRNA以冻干粉的形式常温运输。建议在-20℃或-80℃储存，可分装保存，避免反复冻融。FAM,CY3,CY5等荧光标记的siRNA棕色离心管避光保存。
siRNA溶解
siRNA是冻干粉，附在管壁上，所以开盖前请先离心，再小心打开管盖，溶解后盖上管盖振荡； 并严格遵循RNA操作规则，使用RNase-free的实验耗材进行实验操作，避免RNA降解。使用时最好于冰上放置；